發(fā)布單位	農(nóng)業(yè)部 農(nóng)業(yè)部	發(fā)布文號	農(nóng)業(yè)部公告第2078號
發(fā)布日期	2014-03-12	生效日期	暫無
有效性狀態(tài)		廢止日期	暫無
備注

　　根據(jù)《獸藥管理?xiàng)l例》和《獸藥注冊辦法》規(guī)定，我部組織制定了口蹄疫滅活疫苗內(nèi)毒素和總蛋白測定法，現(xiàn)予發(fā)布，自發(fā)布之日起執(zhí)行。

　　特此公告。

　　附件：1.口蹄疫滅活疫苗內(nèi)毒素測定法

　　2.口蹄疫滅活疫苗總蛋白測定法

　　農(nóng)業(yè)部

　　2014年3月12日

　　附件1

　　口蹄疫滅活疫苗內(nèi)毒素測定法

　　吸取12 ml疫苗放入15 ml離心管中，置50±5℃水浴90分鐘，然后在4℃條件下，以15000 g離心10分鐘，取水相5.0 ml，按現(xiàn)行《中國獸藥典》一部附錄進(jìn)行檢驗(yàn)。每頭份疫苗中內(nèi)毒素含量應(yīng)不高于50 EU。

　　附件2

　　口蹄疫滅活疫苗總蛋白測定法

　　取1瓶疫苗恢復(fù)至室溫，在3個1.5ml離心管中分別精確加入100μl疫苗和900μl丙酮，充分混勻，室溫放置10分鐘，在4℃條件下，以15000g離心15分鐘。吸棄液相，沉淀物用400μl丙酮洗滌2次，室溫干燥約15分鐘，加50μl去離子水復(fù)溶后，按附注進(jìn)行檢驗(yàn)。每毫升疫苗總蛋白含量應(yīng)不高于500μg。

　　附注：口蹄疫滅活疫苗總蛋白測定法

　　1.方法與原理

　　本法適用于口蹄疫病毒油佐劑滅活疫苗總蛋白含量檢測。本法系福林酚法(lowry法)，依據(jù)蛋白質(zhì)分子中含有的肽鍵在堿性溶液中與Cμ2+螯合形成蛋白質(zhì)－銅復(fù)合物，此復(fù)合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，同時在堿性條件下酚試劑易被蛋白質(zhì)中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸還原呈藍(lán)色反應(yīng)。在一定范圍內(nèi)其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比，以蛋白質(zhì)對照品溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用比色法測定供試品中蛋白質(zhì)的含量。

　　2.試劑與儀器

　　2.1試劑丙酮（分析純）、無菌去離子水、商品化Lowry法改良試劑盒；

　　2.2設(shè)備酶標(biāo)儀（全波長），“Μ”型96孔板，卡介苗注射器，單通道和多通道移液器，渦旋震蕩儀，酶標(biāo)板振蕩器等。

　　3.操作步驟

　　3.1標(biāo)準(zhǔn)系列稀釋液制備將商品化試劑盒內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白（2mg/ml母液），按下表依次稀釋。

　　3.2檢驗(yàn)疫苗處理取1瓶疫苗恢復(fù)至室溫?fù)u勻后，在3個1.5 ml離心管中分別精確加入100μl疫苗和900μl丙酮，充分混勻，室溫放置10分鐘，在4℃條件下，以15000 g離心15分鐘。吸棄液相，沉淀物用400μl丙酮洗滌2次，室溫干燥約15分鐘，加50μl去離子水復(fù)溶備用。

　　3.3反應(yīng)板加樣與讀數(shù)

　　3.3.1各取3.1稀釋的各濃度牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液40μl，以及三重復(fù)待檢疫苗樣品40μl，分別加入到96孔板內(nèi)。用排槍迅速加入200μl改良lowry法試劑盒內(nèi)試劑，立即用振蕩器混勻30秒；

　　3.3.2封膜，室溫孵育10分鐘；

　　3.3.3各孔內(nèi)分別加入20μl 1倍酚試劑（試劑盒內(nèi)為2倍，用前用去離子水現(xiàn)稀釋），立即用振蕩器混勻30秒；

　　3.3.4封膜，室溫孵育30分鐘；

　　3.3.5酶標(biāo)儀測定750nm吸光值，保存讀數(shù)。

　　3.4數(shù)據(jù)處理

　　根據(jù)系列標(biāo)準(zhǔn)蛋白稀釋液的濃度（0μg/ml～2000μg/ml）和750nm吸光值，使用EXCEL以吸光值為X軸，以蛋白標(biāo)準(zhǔn)濃度為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)趨勢線求得多項(xiàng)式，其多項(xiàng)式R2≥0.98。

　　將被檢樣品的吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)蛋白獲得的多項(xiàng)式，計算樣品中蛋白含量，根據(jù)取樣量求得1ml樣品中蛋白含量。例如口蹄疫滅活疫苗水相/油相比例為1:1，免疫劑量為2ml時，100μl疫苗經(jīng)丙酮沉淀后用50μl去離子水復(fù)溶，測得濃度即為每頭份疫苗中蛋白濃度，或2ml疫苗中蛋白濃度。結(jié)果判定時，將測定值除以2即得每毫升疫苗中總蛋白含量。

　　3.5結(jié)果判定

　　若測定結(jié)果為每毫升疫苗總蛋白含量小于或等于500μg，則判定被檢疫苗總蛋白含量符合規(guī)定；若測定結(jié)果為每毫升疫苗總蛋白含量大于500μg，判定被檢疫苗總蛋白含量不符合規(guī)定。

　　3.6檢測數(shù)據(jù)處理舉例

　　3.6.1收集數(shù)據(jù)如表所示

　　上述表格中，A1-A9為系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液，A1至A9蛋白濃度依次增高；B、C、D行中1-6列為檢測樣品750nm吸光值，B1-B6為6批不同批次疫苗樣品，每一列為同一疫苗樣品三個重復(fù)。

　　3.6.2繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：將上表中數(shù)據(jù)復(fù)制到EXCELL表格中，

　　3.6.3數(shù)值計算

　　以樣品測定OD750值為X，代入y = 411.69x2+ 220.65x - 3.9423，Y為蛋白濃度，以表中第一批疫苗測定結(jié)果為例。該疫苗三重復(fù)測定的OD750數(shù)據(jù)（X）分別為：0.677、0.640、0.641，代入公式計算蛋白含量（Y）分別為：334μg/ml、306μg/ml、307μg/ml，該數(shù)據(jù)為每毫升水相抗原中總蛋白含量。計算三重復(fù)數(shù)值的平均值（AVERAGE）為316μg/ml，標(biāo)準(zhǔn)差（STDEV.P）為13.1，變異系數(shù)為4.15%（標(biāo)準(zhǔn)差/平均值*100%），將每毫升水相抗原中總蛋白含量，除以2折算為每毫升疫苗總蛋白含量，該疫苗的總蛋白含量為138μg/ml。按照上述方法，可計算其他樣品的總蛋白含量。

　　3.6.4結(jié)果判定

　　同一樣品不同重復(fù)間變異系數(shù)應(yīng)小于5.3%，否則試驗(yàn)不成立，應(yīng)重做。若測定值小于或等于500μg/ml，則判定被檢疫苗總蛋白含量符合規(guī)定；若測定值大于500μg/ml，則判定被檢疫苗總蛋白含量不符合規(guī)定。